大鼠关节炎动物模型造模方案

胶原诱导关节炎（CIA）首次应用是用Ⅱ型胶原免疫Wistar(远亲杂交)、Sprague-Dawley(远亲杂交)和Wistar-Lewis (近交) 中诱导成功。由于此CIA模型具有与人风湿病关节炎（RA）相同的免疫和病理特征，因此该模型先后扩展到小鼠及非人灵长类动物，并已作为人类关节炎研究的广泛应用的模型。然而，对于CIA模型来说，不同种属动物之间是有差异的。小鼠对CIA的敏感性与主要组织相容性复合体（MHC）相关，在小鼠品系中只有DBA/1(H-2^q)和B10.RⅢ(H-2^r)两个品系对CIA敏感。大鼠对CIA的敏感性也与MHC相关，并与小鼠相比具有较宽的品系范围。因此，不同MHC型的不同品系的大鼠，尽管关节炎的发病率、严重程度及抗体和T-cell 的特异性在不同品系间不同，但都能够诱发关节炎。

动物的管理与饲养

动物必须是7-8 周龄健康的并在SPF条件下饲养的动物。一般来说，对于肠道菌群，不管是否致病都显著影响宿主对抗原的免疫应答。无菌的大鼠对佐剂诱发的关节炎高度易感（AIA），其次是SPF级大鼠及一般大鼠敏感性相对较低。即使同一品系,CIA 的发病率及严  重程度也有显著差异，这种差异是由于饲养条件造成的。

众所周知，小鼠的饮食影响  CIA的发病率及严重程度。然而在大鼠在中没有进行广泛研究。与小鼠相比，大鼠对Ⅱ型胶原的免疫应答更快且较短时间内能诱发关节炎，因此饮食对小鼠来可能不是影响关节炎的重要因素。然而，像小鼠一样，饲以高脂肪的食物对诱发关节炎更有利。

大鼠的品系

对Ⅱ型胶原的免疫应答以及关节炎的进展与MHCRT1位点相关而且用于免疫的Ⅱ型胶原的动物来源不同也会造成大鼠对Ⅱ型胶原的免疫应答以及关节炎的进展上的差异。然而，与小鼠相比，很多品系的大鼠对CIA敏感，并能诱发一定程度的关节炎。一般来说，猪的Ⅱ型胶原是最好的致炎胶原其后是牛的二型胶原，鸡的二型胶原致炎性最差。以下大鼠品系是已明确的对CIA高度易感的品系：BB/DR (RT1^u),Wistar Furth, LOU (RT1^u), OM (RT1^u)和 LEW (RT11) 大鼠。

 动物质量也很重要。在这方面，肠道菌群可能是影响机体对二型胶原免疫应答和关节炎进展的重要影响因素之一。例如:Lewis 大鼠对CIA高度易感，同时发病率和炎症严重程度都很高。但是同是SPF级Lewis 大鼠对CIA的敏感性由于年龄、饲养条件及免疫肠道菌而对CIA的敏感性存在显著差异。MDP(胞壁酰二肽)对加强Lewis 大鼠对CIA的发病率和严重程度非常有效。但是我们建议在用Lesis 大鼠造模之前先进行小规模试验，据我们所知BB大鼠是用于CIA造模最好的品系。 DA大鼠对CIA的敏感，但是同时AIA（佐剂诱发的关节炎）及矿物油诱发的关节炎（仅矿物油）高度敏感，因此不推荐用于CIA的造模。

备注：

1.与小鼠相反大鼠对同源（大鼠）Ⅱ型胶原是敏感的，同时诱发和猴一样的关节炎。

2. 与小鼠和猴子相反，大鼠对Ⅱ型胶原抗体是针对Ⅱ型胶原分子构象的特异性抗体。因此胶原变性或免疫Ⅱ型胶原的单独CB肽段都不能在大鼠中致炎。

胶原

 因为去糖基化的胶原会影响关节炎的产生，同时一些未去除的杂质比如：胃蛋白酶可能会导致T细胞刺激试验中产生假阳性，因此Ⅱ型胶原应按规定高度纯化。如果按恰当的方法冻干的胶原-20℃避光保存的条件下，是非常稳定的。纯化的胶原溶于0.05M浓度的醋酸中，终浓度为2-4mg/mL，温和搅拌，4℃过夜。胶原溶液在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供较完整的不同免疫级别的Ⅱ型胶原。（见表1）

乳剂的制备

1）由于大鼠通常对佐剂诱发的关节炎（AIA）是敏感的，因此必须使用不完全佐剂（IFA）,货号是7002。乳剂的质量是能否诱发关节炎高发病率的关键因素。乳剂的制备有多种方法。但是不推荐注射器或超声波处理的方法。这些方法将导致乳剂不能够有效的、稳定的诱发关节炎。此外，超声波处理方法，至少将胶原分成2个片段，这些小片段在正常体温下，很容易变性。推荐使用电动的高速搅拌器：

用高速搅拌器（带直径≤5mm的刀片，Fig.1）搅拌不完全佐剂（IFA）和胶原溶液(Fig 2a)。如果刀片够不到注射器低端，可以把5mL或10mL的注射器从活塞处剪去一半（Fig.2b）。把注射器夹紧，固定在铁架台上，并冰浴。最后一步很重要，因在搅拌过程中会发热，会引起蛋白变性，变性的蛋白不能够诱发关节炎（CIA）。

Fig1. 高速搅拌器Fig2 刀片，截断的注射器，汉密尔顿玻璃注射器

Fig. 截断的注射器，支架上固定，冰浴

2) 加1体积（最多2.5mL）不完全完全佐剂到注射器，再加等体积的胶原溶液（0.05M醋酸溶解的的胶原溶液，终浓度2mg/mL），边低速搅拌边滴入胶原溶液。

3) 继续混合，直到在最大转速产生稳定的乳液（转速约３0０００rpm/2-3 min）。在再次混合前确保乳液是冰浴中。对于大体积（2-5Ml）为了使乳液混合均匀，建议在混匀过程中移动搅拌位置。

 注：可能需重复搅拌2-3次

4) 将一滴乳剂滴与一烧杯水中，检测乳剂的稳定性。如果乳剂是稳定的，在水中是成团的，不散开。

 注：如果乳剂在水面散开，表明乳剂不稳定。再加几滴佐剂，重新混合后，再检测。

5)将乳剂转移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建议采用塑料注射器，因为很难做到一个准确的注射剂量。

注1：通过用力甩注射器将乳剂中的气泡赶出注射器（活塞部向下）。否则很难做到一个精确的注射剂量。

注2：建议在乳剂制备好的一小时内，注射完毕。乳剂在在用前一直保持4℃。

注射部位

在鼠尾根部注射0.2mL(胶原：200μg)乳剂（Fig.4）。例如：从尾根部50px处插入针头，直到针尖插入位置距尾根部0.5cm。针插入皮下且每次注射充分擦拭，防止乳液的露出。针头沿斜向上与鼠尾方向平行插入。如果要加强免疫，注射部位在尾根部3Cm处，针尖插入皮下据鼠尾根部1.5cm处。

注1：背部皮下注射也非常有效，但需注射更多的胶原乳剂（0.5-1ml）。

注2：无论如何，我们不建议背部皮下注射或腹腔注射胶原乳剂和佐剂，如初次免疫或加强免疫。因为不完全佐剂在腹膜和腹腔引起严重的炎症反应。

免疫程序

Ⅱ型胶原的自身IgG抗体水平及其亚型（可激活补体），对关节炎发生很重要。依据实验目的有很多种方法可诱发高发病率的关节炎。

a.  通过单次免疫（无加强免疫）诱发关节炎

依据说明书方法制备乳剂（胶原-不完全佐剂）和免疫，由于不同品系的的敏感性的差异，一般在2-3周可诱发关节炎。在一些免疫应答较强的品系，发病率达到80-90%。对于一些高度易感品系如BB大鼠，关节炎严重程度，临床评分可达到10-12分（最高16分）。

b 通过加强免疫诱发关节

为了确保关节炎的发病率和严重度，可在初次免疫7天后加强免疫。按说明书方法，准备胶原-不完全佐剂，尾部皮下注射0.1mL,会短时间内产生严重的关节炎。

按要求制备胶原+IFA 乳剂（1：1）

初次免疫(0day) ：200 ul乳剂/只

加强免疫（7day）：100ul 乳剂/只

关节炎的发生

于小鼠相比（约4周），关节炎在大鼠中产生的更快，初次免疫后，2-3周出现关节肿胀。在BB大鼠发生关节炎的时间比其它品系更快，约12-14天。如果免疫有效，3周后100%发生关节炎。

临床评分

关节炎可通过临床评分来定性评估或用测厚仪来测量爪子厚度来评估。这些方法适用于所有的关节炎模型比如经典的CIA，佐剂诱导的关节炎和棉线诱导的关节炎。

                                                      表2  关节炎炎症程度的临床评分