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人尿液中I型胶原交联氨基末端肽（NTX）

NTX Urine

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中文名称：: 人尿液中I型胶原交联氨基末端肽（NTX）

英文名称：: NTX Urine

品牌：: Abbott

货号：: 9006

规格：: 96T

说明书：

OSTEXOMA® NTX Urine 试剂盒说明书（cat#9006）
酶联免疫吸附法（EIA）定量检测人尿液中I型胶原交联氨基末端肽（NTX）

产品应用：
Osteomark 用于定量测定分泌的交联型I型胶原N端肽（NTX）。NTX是骨吸收的一种标记物，尿液NTX水平的升高标志着骨吸收水平的升高。NTX的测量用于以下用途：
A．预测绝经后妇女用激素抗吸收治疗的骨骼反应（骨密度）。
B．治疗监测

绝经后妇女的抗吸收治疗
诊断为骨质疏松症人群的抗吸收治疗
诊断为佩吉特骨病人群（Paget’s Disease）的抗吸收治疗
雌激素治疗监测

C．发现对于绝经妇女补钙和激素治疗一年后骨密度下降的可能性。
Osteomark 的检测范围是20~3000nM骨胶原当量（BCE）
实验说明：
哺乳动物通过破骨细胞介导的骨吸收，伴随由成骨细胞介导的骨形成的连续过程，而不断的重建，这个过程对骨骼的正常发育和维持是必不可少的，这个紧密结合的过程的异常往往导致骨量和形状的改变。对特异的骨降解产物的测定，可以作为研究骨代谢率提供分析数据。
约90%的骨组织基质是I型胶原，I型胶原是一种由C端和N端交联的螺旋蛋白，这种蛋白组成了骨组织的基本结构和张力。NTX(交联型I型胶原C末端肽)的发现为骨吸收提供了一种特异的生化标记物，这种标记物可用于免疫检测。NTX作为骨检测特性分子，是由于其唯一氨基酸序列和a2端肽的结构方向。NTX分子的产生是由骨中破骨细胞介导的，作为一种稳定的降解终产物存在于尿液中。
OSTEXOMAR®试剂盒用于定量测定尿液中的NTX。尿液中NTX水平的升高标志着骨吸收水平的升高。骨吸收水平的升高是与年龄相关的骨量降低的首要原因。低骨量常常导致骨量减少，是骨质疏松的主要原因。当骨吸收水平高于骨形成水平时骨量降低。据报道，骨质疏松性骨折是老年妇女发病率和死亡率升高的主要原因。
对接受激素治疗（HRT）和补钙（500mg/ 天）或仅进行补钙的绝经妇女进行了一次随机、前瞻性的临床试验。试验结果支持用Osteomark的试剂盒预测的反应和监测抗吸收治疗的效果。
用OSTEXOMAR®试剂盒监测抗吸收治疗的应用，在一项用双磷酸盐（alendronate sodium, 10 mg）治疗骨质疏松病人的研究中得到了陈述。结果表明骨质疏松病人在经过三个月的治疗后，其Osteomark值应被控制在≤35 NM BCE/mM肌酐或者经过3个月的治疗后≥40%偏离于基线。
为了测定Osteomark试剂盒在监测佩吉特骨病人（Paget’s Disease）抗吸收治疗效果的能力，进行了一项研究。Osteomark试剂盒基线值于治疗开始后于基线的变化率都于血清碱性磷酸酶总量相关。在治疗效果上，Osteomark试剂盒检测值用于早期治疗后的早期评估。抗吸收治疗三个月后，佩吉特骨病人（Paget’s Disease）应偏离基值30%以上。
检测原理：
OSTEXOMAR®试剂盒采用竞争法测定，用包被有NTX的微孔为固相，标本中的NTX和固相中的NTX竞争结合HRP标记的NTX单克隆抗体。结合到固相上的抗体的量和结合到标本中的NTX的抗体量成反比。标本中NTX的浓度通过吸光度发测定。通过标准曲线计算出。稀释的尿液测定通过肌酐分析校正，用nMBCE/mmol 肌酐/L表示。
试剂盒组成：

	组分	规格
A	抗原包被的96孔板	1块
B	浓缩标记抗体	0.4ml
C	抗体稀释液	30ml
D	30X浓缩洗液	125ml
E	显色剂	0.9ml
F	底物缓冲液	30ml
G	终止液	25ml
1	1nM BCE 标准品	0.4ml
2	30nM BCE标准品	0.4ml
3	100nM BCE标准品	0.4ml
4	300nM BCE标准品	0.4ml
5	1000nM BCE标准品	0.4ml
6	3000nM BCE标准品	0.4ml
I	尿质控品I	0.4ml
II	尿质控品II	0.4ml
III	封板膜	1包

试剂说明：
96孔板： 96孔（12x8）可拆板，包被有合成的NTX。
抗体：1瓶，纯化的小鼠NTX单抗-HRP标记（含保护剂）。100X浓缩液（0.4ml）
抗体稀释液：1瓶，用于抗体稀释（含保护剂）30ml。
30X洗液：30x浓缩洗液。
显色剂：100x浓缩液（0.9ml）
底物缓冲液：过氧化氢缓冲液 (30ml)
终止液：1瓶，1N硫酸（25ml）
标准品：分析用标准品：1,30,100,300,1000,3000nM BCE（各0.4ml）。
质控品：尿液质控品I，II，各一管。
试剂保存：
试剂2-8℃保存，用前置于室温平衡。不要将试剂置于30℃或者2℃以下环境中，稀释后的洗涤液可在室温存放1个月。
试剂盒不提供的设备/试剂：

移液器
枪头
塑料容器
自动洗板机
酶标仪
曲线拟合软件
去离子水

尿标本的收集保存：

收集早晨的第二次晨尿或者24小时尿标本，盛于密闭容器中。
尿标本中不要加保护剂
带血标本或溶血标本可能对测定造成影响，建议重新采集样本。
尿标本2-8℃可以保存72小时，室温可保存24小时，冷冻（≤20℃）可长期保存，避免反复冻融。
监测治疗时，基准标本应该在治疗开始前收集，后续收集的用于比较治疗效果的标本收集的时间应与基准标本收集的时间一致。

注意事项

仅供体外诊断用
96孔板、标准品和尿液质控品汇总含有从人尿液或骨组织提取的抗原，应做适当处理。
终止液中含有1N硫酸，不要溅到皮肤或眼睛中。一旦被溅到，立即用水冲洗15分钟，溅如如眼睛时要立即就医。
显色几种含有TMB和DMSO。DMSO易被皮肤吸收，吸入、寄出皮肤或吞咽多会造成伤害，一旦暴露，应立即用流水冲洗暴露部位15 分钟，如溅入眼中，立即就医。
尿液标本中可能含有传染源，应做正确处理，用0.5%的次氯酸钠溶液或121℃高压消毒1小时。不要高压次氯酸钠的溶液，也不要将次氯酸钠和酸混合。
决不要用嘴吸试剂或临床标本。
处理标本和试剂时要穿防护衣，戴防护手套，用完后彻底洗手。
不要使用过效期试剂。
不要将不同批号的试剂混合使用。

10）微孔板必须干燥保存，未使用的板条应当用盛有干燥剂的密封袋重新密封保存。
11）测定程序要在符合温育要求的实验环境中进行，测试中要避开极端的环境条件。
操作流程：

测定前至少将标本和试剂盒在室温（18-28℃）平衡1小时。为了偏于加温，将试剂从世纪合众取出，冰冻状态的尿标本，可用水浴或温育箱37℃解冻后，置于室温。显色几种含有DMSO,冷冻后是有可能是固体，室温状态下是液体。
制备1X的洗涤液。将30X的洗涤液用去离子水1:30稀释（1份30X浓缩洗涤液+29份去离子水）。至少混匀5分钟，稀释后的洗涤液在室温可保存1个月。
做一个标准品、质控品和尿标本位置的孔排布图。建议标准品、质控品和尿标本都做复孔，以下是测试4例样本的排布图。


1nM 标准品	1000nM 标准品	1
1nM 标准品	1000nM 标准品	1
30nM 标准品	3000nM 标准品	2
30nM 标准品	3000nM 标准品	2
100nM 标准品	I	3
100nM 标准品	I	3
300nM 标准品	II	4
300nM 标准品	II	4

准备一个一次性塑料容器,用抗体稀释液1:101稀释浓缩抗体。对于整块板，建议：
20ul的抗体浓缩液用2ml的抗体稀释液去稀释，轻轻旋转混匀，不要涡旋混匀或用磁力搅拌。配好的抗体稀释液1小时使用，容器不要重复使用。
测定前轻轻混匀标准品、质控品和尿液标本，不要形成泡沫。混浊样本放置5-10分钟再吸样，含沉淀的尿标本，用前请离心。
取出需要数量板条，剩余放回密封袋，沿拉链密封，保留干燥剂。

7．根据步骤3种的孔排布，加入25ul的标准品、质控品、尿液标本于相应的微量孔中。
加样枪用前校准，每次家养后需要换新的吸头。
8.用排枪加入200ul的稀释后的抗体，用封板膜封板，在平面上轻轻混匀5-10秒。

室温（18-28℃）孵育90±5分钟。
在温育后的最后10min准备显色底物溶液，将显色液（Chromogen）加入底物缓冲液（Buffered Subsrate）中。建议，如果是整版的，去20ul显色液加入到2ml的底物缓冲液中。底物缓冲液加到一个一次性塑料容器中，将显色液充分混匀后加到底物溶液中，轻轻混匀，不要剧烈摇动或使用磁力搅拌。配置的显色底物缓冲液要在30分钟内使用。混匀后溶液应当是无色的，蓝色表明试剂被污染，应当弃掉。配置显色底物缓冲液的容器不可重复利用。
温育结束，小心揭去密封条，在自动洗板机上用洗液洗板5次，每次冲洗循环没空最少350ul洗液。洗板过程中，每孔中应加满洗涤液。冲洗结束，倒置板，在吸水纸上排干。立即加入上述配好的显色底物缓冲液。

显色和测定

用排枪取200ul第10步配置好的显色底物缓冲液加入到各孔。用封板膜封板。
室温孵育15±1分钟，结合有HRP标记抗体的孔会有蓝色显色。
孵育结束后，小心揭去封板膜。用排枪加入100ul终止液，孔内颜色由蓝色变为黄色。
在平面上将微孔板轻轻旋转混匀5-10秒，室温繁殖5分钟后测吸光度值。
加入终止液后30分钟内，酶标仪读取标准品、质控和样本吸光度值。主波长450nm,副波长630nm，酶标仪应能保证最大OD≥3.0。

结果分析：
1.采用4参数曲线拟合的方式，做标准曲线计算样本和质控的浓度值（nM BCE）。

2.结果在满足以下条件下是有效的：
1）1nM BCE标准品的平均OD值必须≥1.5
2）1nM BCEE标准品OD值和3000NM BCE标准品OD值相差应≥1.3
3）样本复孔间的变异系数（CV%）应≤20%。样本，CV%≥20%的应该重测。
4)最低检测值20 nM BCE(不包括肌酐调整值)
5）样本浓度超过3000nM BCE需要用200-500nm BCE的尿样做1:5稀释后再测。当用样本做稀释液时，这个稀释液的nm BCE也要在同一块板上测定出来。稀释倍数和背景（稀释液的nm BCE值）也要合并计算。
例如：用测值是300nM BCE的尿液做稀释液，以1:5的比例稀释4000 nMBCE的样本，测值为：1040nM BCE。
1040 nM BCE - (0.8 x 300 nM BCE) = 800 nM BCE
800 nM BCE x 5 (稀释倍数) = 4000 nM BCE
注：1:5稀释表示稀释液（作为稀释液的尿液中）的NTX 占20%

检测报告的测值用：nM BCE/ mM肌酐表示，例如：

测定值：360 nM BCE
尿肌酐值：60mg/dL肌酐/11.3（转化因子）=5.3mM肌酐
360 nM BCE/5.3 mM肌酐=68 nM BCE/ mM肌酐
注：11.3(转化因子)：将毫克/分升（dL）转换为毫摩尔/L的转化因子。

厂家建立了自己的质控范围，建议每个实验室建立自己的质控范围。

局限性：
虽然NTX被用作骨吸收检测标记物，但尚未用于预测骨质疏松症的形成和未来发生骨折的风险，也未用于诊断原发性甲状旁腺机能亢进、甲状腺甲状腺机能亢进。当用该试剂盒监测治疗效果时，可能会受到影响骨吸收的其他临床条件的影响。例如：骨转移。由于报告结果不包含时间因素，单一的Osteomark值不能提供骨吸收率。其结果应当结合临床和其他诊断结果综合分析。
干扰物质：
对尿液中各种可能对测定造成干扰的成份和微生物进行了评估。已检测微生物，如：大肠杆菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、白色假丝酵母菌（ATCC 14053）都对测定无干扰，人白蛋白、胆红素、糖和维生素C对测定也无干扰。血尿标本和溶血标本可能对测定造成干扰，应弃掉，重新采样。
预测值
表1：男性和绝经前妇女测值预期范围

	均值*	标准差	范围（均值±SD）*	N
妇女	35	15	5-65	258
男子	33	15	3-63	206
*以 nM BCE/mM肌酐表示

绝经前妇女的预期值范围经对数转换后为：14-74nM BCE/mM肌酐
男性参考范围为：13-78nM BCE/mM肌酐
从对健康绝经后妇女（n=276,268）和30岁以上的男人（n=36,35）的研究中确立了短期和长期的变异。连续收集3-4天尿标本测定短期变异，连续收集2-3个月尿标本测定长期变异。短期变异：妇女15%，男男子：18%。长期变异：妇女18%，男性19%
重复性和精密度：
批内差异：由4个操作者分别对8份尿液标本重复测定10次而评估的。结果如下：

标本	均值（nM BCE）	变异系数%
A	26	19
B	111	8
C	172	8
D	417	5
E	694	5
F	1113	5
G	1768	6
G	2640	5

批间差异：由一个操作者对3分尿标本重复测定20次，进行评估，结果如下：

标本	均值（nM BCE）	变异系数%
A	79	5
B	412	3
C	1167	4

精密度：是通过30天中在3家临床实验室测定尿液质控品I和尿液质控品II进行评价的。尿液质控品I的均值为439 nM BCE，变异系数为10%，尿液质控品II的均值为1537 nM BCE，变异系数为7%。
抗原回收：
抗原回收是通过向3份已知NTX浓度的尿标本中加入已知量的NTX来评价。回收表示测得值占理论值（尿液基准值加新加入的抗原（NTX）值）的百分比，结果抗原回收率是105%。
线性检测：
稀释线性是通过对4分高nM BCE的尿液标本用200-500 nM BCE的尿液标本做系列稀释来评价。结果显示相关系数r=0.999 或 r=1.0000
注：中文译文仅供参考，请以英文说明书为准

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